蛋白層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑，一般制備用凝膠柱，直徑大于2厘米，但在加樣時應將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。此外，直徑加大，洗脫液體體積增加，樣品稀釋度大。
分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床要有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞，一般不超過1米。分族分離時用短柱，一般凝膠柱長20－30厘米，柱高與直徑的比較5：1─10：1，凝膠床體積為樣品溶液體積的4－10倍。分級分離時柱高與直徑之線為20：1─100：1，常用凝膠柱有50×25厘米，10×25厘米。
蛋白層析柱濾板下的死體積應盡可能的小，如果支掌濾板下的死體積大，被分離組分之間重新混合的可能性就大，其結果是影響洗脫峰形，出現拖尾出象，降低分辯力。在準確分離時，死體積不能超過總床體積的1／1000。
始終保持柱內液面高于凝膠表面，否則水分蒸發，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內的流動。所用凝膠比較昂貴，需小心操作，實驗后回收，盡量避免浪費和損失。
要很注意的是，各接頭不能漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。裝柱要均勻，既不過松，也不過緊，要在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過快，避免因此壓緊凝膠。
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